Rudolf war des erste von neun Kindern des aus den Niederlanden nach Hamburg geflüchteten Kaufmanns Willem Amsinck (1542-1618) und Henrica, geb. van de Rouse.

Er betätigte sich als Kaufmann und wurde 1618 Mitinhaber der väterlichen Assekuranzfirma "Rudolf und Arnold Amsinck". Zwischen 1615 und 1619 gründete er eine Drahtmühle in Grönwohld bei Trittau/Holstein. 1619 wurde er Ratsherr, Senator und Mitbegründer der Hamburger Bank. Er wurde 1623 Prätor (oberster Gerichtsherr) und gehörte der im selben Jahr gegründeten Admiralität an. 1625 war er Bauherr und 1633 Bankoherr. Amsinck war mehrfach hamburgischer Gesandter zu den Niederlanden, Dänemark und zu den Hansetagen. Seit 1618 war er Jurat an St. Petri und seit 1626 Colonellherr von St. Katharinen. Er besaß mehrere Grundstücke in Curslack/Vierlande, Billwerder und auf der Insel Nordstrand. Rudolf Amsinck gehörte zu den vermögendsten Hamburgern seiner Zeit.

Rudolf Amsinck heiratete am 22. November 1601 Isabeau (Isabella), geb. de Hertoghe (1583-1662), mit der er 14 Kinder hatte.